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金线莲的体外抗癌活性研究

时间:2013-09-15 09:56 来源:金线莲之家 作者:消息 阅读:

  1、广东药学院·药科学院,广东广州510006;

  2.、华中科技大学同济医学院附属同济医院,湖北武汉430030;

  3.、华中科技大学同济医学院·药学院,湖北武汉430030;

  4.、湖北省天然药物化学与资源评价重点实验室,湖北武汉430030)

  摘要: 目的对金线莲Anoectochilus roxburghii ( Wall. ) Lindl. 中富含的主要成分kinsenoside 进行抗癌活性研究。方法采

  用磺酰罗单明Sulforhodamine B ( SRB) 法和MTT 分析法。结果对3 种敏感细胞株: 人白血病细胞株( HL - 60 ) 、人肺癌

  细胞株( A - 549) 、人肝癌细胞株( BEL - 7402) 筛选结果10 - 5mmol /L 的化合物kinsenoside 时抑制率均小于85%,评定

  为无效。结论化合物kinsenoside 的抗癌活性不显著。

  关键词: 金线莲; kinsenoside; 抗癌

  DOI 标识: doi: 10. 3969 /j. issn. 1008-0805. 2010. 10. 011

  中图分类号: R962 文献标识码: A 文章编号: 1008-0805( 2010) 10-2444-02

  金线莲( Herba Anoectochili) 为兰科开唇兰属植物花叶开唇兰Anoectochilus roxburghii( Wall. )Lindl. 的干燥全草,是多年生珍稀中草药,有清凉解毒、滋阴降火、消炎止痛之功效,可用于治疗肺结核咯血、糖尿病、肾炎、膀胱炎、重症肌无力、遗精、风湿性及类风湿性关节炎、小儿惊风、妇女白带以及毒蛇咬伤等症; 生于山地林下阴湿地,在我国分布于浙江、福建、台湾、江西、西藏等省区[1],俗称“金草”“神药”“药王”“乌人参”等。化学成分方面除发现金线莲中氨基酸,微量元素及糖类的含量高外,还有黄酮类、甾体、三萜类等化合物分离鉴定的报道[2 ~ 4]。通过对野生金线莲的化学成分研究,鉴定了两个丁酸苷类化合物β - D - glucopyranosyl- ( 3R) – hydroxybutanolide ( Ⅰ,kinsenoside),methyl 4 - β - D - glucopyranosyl - butanoate( Ⅱ) [5],并发现kinsenoside 含量很高。Kinsenoside 作为开唇兰属多种植物含有的主要成分,其降血糖[6]、保肝护肝[7]、降血脂[8]等活性已多有研究。本实验选取3 种敏感的肿瘤细胞株,对该化合物进行抗肿瘤活性测试。

  1 材料与试剂

  1. 1 肿瘤细胞株和培养基人白血病细胞株HL - 60、人肺癌细胞株A - 549、人肝癌细胞株BEL - 7402 ( 中国科学院细胞库) 培养在含10%胎牛血清( 杭州四季青生物工程材料有限公司) 的RPMI 1640 培养基( Gibco 公司) 中,培养条件为: 37℃,饱和湿度,5% CO2的培养环境。

  1. 2 试剂3 - ( 4,5 - dimethylthiazol - 2 - yl)- 2,5- diphenyl tetrazolium bromide( MTT) ( Sigma公司) 溶解在过滤除菌的1 × PBS ( pH 值7. 4,NaCl 0. 8%,KCl 0. 02%,Na2HPO40. 144%,KH2 PO4 0. 024% ) ,终浓度0. 5 mg /ml; SRB ( 美国Sigma 公司) 溶解在1% 的乙酸,终浓度4 mg /ml; SDS( 北京鼎国生物技术发展有限公司) 溶解在10 mmol /L 的盐酸中,终浓度为10%; 注射用盐酸阿霉素( Adriamycin,ADM) 购自浙江海正药业股份有限公司。

  受试药kinsenoside 纯度经鉴定在98% 以上; 金线莲药材由福建省漳州市南靖县和溪镇供销社提供,由中国科学院武汉植物研究所王映明教授鉴定。

  2 方法

  2. 1 MTT 比色法体外抗肿瘤药物筛选取处于指数增长期细胞种在96 孔板里( 细胞浓度为20 000 个/ml, 100 μl /孔) ,培养24 h 使细胞贴壁,去除上清,加200 μl /孔带药新鲜培养基:化合物事先溶解在DMSO 或者生理盐水里,当测试时用完全培养基稀释成所需浓度,注意DMSO 终浓度不能超过0. 1%。每个浓度设6个复孔,并设空白对照孔( 只加培养基) 和阴性对照,同样设6 个复孔。培养实验要求时间,去除上清,加100 μl /孔浓度0. 5 mg /ml 的MTT。培养4 h 后再补加100 μl /孔的10%的SDS。37℃下10 h 后取出,微震荡5 min,放置室温下30 min,在A570nm 波长下测OD 值,并计算抑制率。

  抑制率( %) =对照组OD 值- 测试组OD 值对照组OD 值× 100%

  2. 2 SRB 法体外抗肿瘤药物筛选取处于指数增长期细胞种在96 孔板里( 细胞浓

  度为20 000 个/ml, 100 μl /孔) ,培养24 h 使细胞贴壁,去除上清,加200 μl /孔带药新鲜培养基: 化合物事先溶解在DMSO 或者生理盐水里,当测试时用完全培养基稀释成所需浓度,注意DMSO 终浓度不能超过0. 1%。每个浓度设6 个复孔,并设空白对照孔( 只加培养基) 和阴性对照,同样设6 个复孔。继续培养至试验设计时间,终止培养,去除上清,每孔加10% TCA 200 μl,4℃条件固定l h。用二次蒸馏水

  冲洗5 遍,自然晾干后每孔加入4 mg /ml SRB 溶液,室温下染色15 min,弃上清,用1%乙酸冲洗5 遍以去除非特异性结合的染料。每孔加入100 μl 10 mmol /L Tris溶液,在A515nm 波长下测OD 值,并计算抑制率( 计算方法同MTT 比色法) 。

  3 结果

  见表1 ~ 2。

  4 讨论

  从上述的测试结果来看,化合物kinsenoside 对敏感细胞株初筛的细胞毒活性不明显,不再进行其他细胞株的复筛。本研究将化学与药理方面有机结合起来,对金线莲中富含[8]的主要成分kinsenoside在抗肿瘤方面的药理活性进行了测试,为全面评价活性化合物kinsenoside的药理作用和药用价值提供了科学依据。王常青等[9]初步研究表明,金线莲多糖对癌细胞具有较好的杀伤作用。

  参考文献:

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